Fondato, con un numero chiuso di 18 partecipanti, dall’arcivescovo Onofrio Bartolini dei Medici nel 1552 come Congregazione dei Chierici per il servizio alla cattedrale, fu trasformato, con l’assegnazione di vari benefici vacanti, in Seminario arcivescovile dall’arcivescovo Matteo Rinuccini nella sinodo diocesana del I giugno 1580.
Il primo edificio seminariale fu iniziato nel 1584 in piazza dell’Arcivescovado sul luogo della sede del Capitolo della Cattedrale (attuale Museo dell’Opera del Duomo) ad opera di Carlo Antonio Dal Pozzo e portato a termine da Giuliano dei Medici nel 1626. La sua utilizzazione cominciò il I ottobre 1630.
Un settantennio più tardi, l’arcivescovo Francesco Pannocchieschi d’Elci, oltre ad emanare numerosi provvedimenti a favore del Seminario, acquistò nel 1696 un edificio nella più salubre via Tavoleria per il soggiorno estivo dei seminaristi. Il suo successore Francesco Frosini riorganizzò il Seminario e gli lasciò in eredità la sua ricca e vasta raccolta libraria, dando così inizio alla Biblioteca, oggi Cateriniana, e destinando al mantenimento del bibliotecario parte dei redditi provenienti dal palazzo dei Medici sul Lungarno, vicino alla chiesa di S. Matteo (attuale Prefettura).
Sul finire del XVIII secolo, nel 1784, Angiolo Franceschi promosse il trasferimento del Seminario nel soppresso convento domenicano di S. Caterina, istituendovi anche un Collegio per studenti laici. La sua dotazione finanziaria fu costituita dalle rendite, oltre a quelle di S. Caterina, dei soppressi monasteri di S. Teresa e di S. Frediano. Gli edifici conventuali furono completamente ristrutturati tra il 1785 e il 1789 e, per la villeggiatura estiva, fu scelto dapprima il castello arcivescovile di Calci e poi, nel 1804, la villa Boscaini a Filettole, appositamente acquistata.
Il suo successore Ranieri Alliata arricchì nel 1819 la biblioteca del Seminario di una grande quantità di libri col lascito testamentario di Cesare Malanima e si preoccupò, a partire dal 1827, di ampliare l’edificio e di emanare nuove norme per la conduzione dell’istituto.
Nella seconda metà del XIX secolo, Cosimo Corsi vi istituì le due nuove cattedre di Storia Ecclesiastica e di Patrologia e Sacra Eloquenza, dotò la Cappella di arredi sacri e nel 1870 di reliquie, ingrandì a sue spese la villa di Calci e lasciò alla biblioteca i suoi libri. Il 12 novembre 1856 aveva inoltre fondato in S. Nicola il Piccolo Seminario per gli allievi più poveri.
Dopo di lui l’arcivescovo Ferdinando Capponi divise, nel 1889, il collegio dal Seminario e due anni più tardi fornì i due istituti di un osservatorio meteorologico, lasciando però una difficile situazione economica che fu poi sanata dal successore cardinale Pietro Maffi. A lui si dovette un riordino spirituale e culturale del Seminario e l’emanazione di un nuovo regolamento. Dopo che nel 1874, sotto l’episcopato del Micallef, era stata soppressa la Facoltà di Teologia dell’Università, il 22 novembre 1909 egli la ricreò all’interno del Seminario, dove istituì anche la cattedra di sociologia, affidandola a Giuseppe Toniolo. A partire dal 1904 promosse radicali lavori di restauro e trasformazione del fabbricato; l’anno successivo fece giungere le Suore della Carità della S. Capitanio, dette di Maria Bambina.
Dopo il secondo conflitto mondiale, l’arcivescovo Camozzo, con la collaborazione di mons. Mario Estivi, rettore del Seminario e dell’Istituto S. Caterina, intraprese nuovi lavori di ristrutturazione, ampliamento ed ammodernamento del complesso e realizzò, tra il 1952 e il 1953, il «Pensionato Toniolo» per studenti universitari. La villa di Calci fu infine trasformata in casa per esercizi e incontri spirituali col nome di «Oasi del S. Cuore»